style="width:3.6934in;height:4.35336in" />M 1 2 本文是学习GB-T 34728-2017 无乳支原体PCR检测方法. 而整理的学习笔记,分享出来希望更多人受益,如果存在侵权请及时联系我们
本标准规定了无乳支原体PCR 检测方法的技术要求。
本标准适用于检测羊(山羊和绵羊)临床样品和分离培养物中无乳支原体的核酸。
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GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法
下列缩略语适用于本文件。
CA: 接触传染性无乳症(Contagious Agalactia)
Maga: 无乳支原体(Mycoplasma agalactiae)
PCR: 聚合酶链式反应(Polymerase Chain Reaction)
TAE: 核酸电泳缓冲液(Tris-Acetic acid-EDTA)
CCU: 颜色变化单位(Color change unit)
Taq 酶：Taq DNA聚合酶(Taq DNA Polymerase)
DNA: 脱氧核糖核酸(Deoxyribonucleic Acid)
dNTPs: 脱氧核糖核苷三磷酸(Deoxyribonucleoside Triphosphates)
bp:碱基对(Base Pair)
高速冷冻离心机、PCR
扩增仪、核酸电泳仪、水平电泳槽、恒温水浴锅、普通冰箱、低温冰箱(一70℃)、
凝胶成像系统、高压灭菌锅、组织匀浆设备。
微量加样器(0.5μL～10μL、2μL～20μL、20μL～200μL、100μL～1000μL)、0.22μm
无菌滤
器、无菌棉拭子、灭菌采样容器。
5.1 2×PCR 反应预混合液(含 Taq 酶、dNTPs 和上样缓冲液)。
5.2 DL2000 DNA 分子质量标准。
GB/T 34728—2017
5.3 电泳缓冲液(TAE)、1% 琼脂糖、0.85%生理盐水、Maga
培养基，配制方法见附录 A。
5.5 阴、阳性对照(制备方法见附录 B)。
5.6 商业合成的引物，上游引物(MAGAUVRC1-L)
的序列为：5'-CTCAAAAATACATCAACAAGC-3';
下游引物(MAGAUVRC1-R) 的序列为：5'-CTTCAACTGATGCATCATAA-3'。
合成的引物用符合
GB/T 6682规定的分析实验室用水(蒸馏水)配成20 pmol/μL。
乳腺炎病羊无菌采集的新鲜奶样置于灭菌容器中(不少于1.5 mL)。
关节炎病羊无菌采集的关节液置于灭菌容器中(不少于1.5 mL)。
角膜结膜炎病羊用灭菌棉拭子在的眼结膜表面和眼角轻轻擦拭后置于灭菌容器中。
刚扑杀或死亡时间不超过24 h
病畜采集乳房病变部位组织及其附近淋巴结，置于灭菌容器中。
6.2.1
以上样品采集后应立即置于带有冰袋的运输箱中，送至实验室检测。样品被运到实验室时，附
带的冰袋应没有完全融化。
6.2.2
如样品不能被及时送到实验室，应置于-20℃冰箱中保存，保存期应不超过1个月；如需长期保
存样品，应置于-70℃冰箱。
与生理盐水等体积混匀后，4℃、13000 r/min 离心10 min, 弃上清，收集沉淀。
与生理盐水等体积混匀后，4℃、13000 r/min 离心10 min, 弃上清，收集沉淀。
浸入1 mL 生理盐水中30 min,
充分捻动，挤干后弃去拭子，将浸出液在4℃、13000 r/min 离心
剪成小块，按1 g 加入0.9 mL 生理盐水研磨后，在4℃、3000 r/min 离心10
min, 弃沉淀。取上清
在4℃、13000 r/min 离心10 min 后，弃上清，收集沉淀。
GB/T 34728—2017
分离的疑似 Maga 培养物取1 mL,4℃、13000 r/min 离心10 min
后，弃上清，收集沉淀。
阴、阳性对照样品各1 mL,4℃、13000 r/min离心10 min
后，弃上清，收集沉淀。
用适宜的基因组 DNA 提取试剂盒，按照说明书提取样品基因组 DNA,
提取物最终体积为50μL。
DNA 提取操作应在通风柜中进行。
按下列方法配制50 μL 反应体系：
DNA 模板 5μL
2×PCR 反应液 25 μL
上游引物 1μL
下游引物 1μL
灭菌去离子水 18μL
每次反应设阴、阳性样品对照和空白对照，阴性样品对照用Maga 培养基提取的
DNA 作为模板，
阳性对照用Maga 灭活培养物提取的DNA
作为模板，空白对照用灭菌去离子水作为模板。
加样后，置于 PCR 扩增仪进行反应，反应条件如下：95℃5 min 进行 PCR
预变性，然后进行35个
循环的扩增(94℃ 30 s,50℃ 30 s,72℃60s),最后72℃延伸10 min,4℃ 保存。
取 PCR
产物各5μL(包括被检样品，阴、阳性对照样品、阳性质粒对照和空白对照),分别和1
μL 6×PCR 上样缓冲液混合均匀后，连同 DNA
分子质量标准在1%琼脂糖凝胶中进行电泳，凝胶成像系
统中观察结果(参见附录C)。
电泳观察显示，阳性对照有1624 bp
的特异性扩增条带，阴性和空白对照没有相应条带，则试验
成立。
符合7.1的条件，样品出现1624 bp 的特异性扩增条带判为 PCR
结果阳性，表述为检出无乳支原
体核酸。样品无特异性的阳性扩增条带判为 PCR
结果阴性，表述为未检出无乳支原体核酸。
GB/T 34728—2017
(规范性附录)
溶液的配制
A.1 TAE 电泳缓冲液(pH 8.0)的配制
Tris 碱 242 g
EDTA 37.2 g
冰乙酸 57.1 mL
加去离子水至1000 mL, 使用前用去离子水50倍稀释。
A.2 1% 的琼脂糖电泳凝胶板制备
将琼脂糖1g 加入100 mL1×TAE
电泳缓冲液中，加热融化，温度降至60℃左右时加入适宜的核
酸染料，均匀铺板，厚度为3 mm～5 mm。
A.3 0.85% 生理盐水的配制
将8.5 g 氯化钠溶入1000 mL 去离子水中，分装后在121℃灭菌20
min,或过滤除菌，置2℃~8℃
保存。
A.4 Maga 培养基制法
A.4.1 成分
PPLO 肉汤(不含结晶紫) 21 g/L
25%鲜酵母浸液 100 mL/L
灭活马血清 200 mL/L
5%醋酸铊溶液 4 mL/L
青霉素 2 0 万 IU/L
葡萄糖 2 g/L
丙酮酸钠 2 g/L
0.4%酚红 0.18 mL
A.4.2 制备方法
将21gPPLO 肉汤溶于700mL 去离子水中，116℃高压灭菌30
min,其余成分混合溶解后用0.22 μm
滤膜过滤，无菌加入冷却的PPLO 肉汤中，用灭菌的1 mol/L NaOH 调 pH
至7.6～7.8,分装试管或三
角瓶等，2℃~8℃保存备用。
GB/T 34728—2017
(规范性附录)
无乳支原体阳性样品和阴性样品制备
B.1 阳性样品制备
取 Maga
培养物，向培养物中加入40%甲醛溶液，使终浓度为0.2%(40%甲醛溶液),37℃灭活
18 h,用 Maga 培养基10倍梯度稀释至1000 CCU/mL, 分装0.5 mL/ 管备用。
B.2 阴性样品制备
用Maga 培养基，分装0.5 mL/ 管备用。
GB/T 34728—2017
(资料性附录)
检测样品电泳例图及靶基因片段的核苷酸序列
C.1 检测样品电泳例图
检测样品电泳例图见图 C.1。
style="width:3.6934in;height:4.35336in" />M 1 2
250bp
说明：
M——DNA 分子质量标准DL2000。
图 C.1 PCR 检测电泳例图
C.2 PCR 扩增靶基因片段序列
大写字母为引物所在位置(PG2 株，Genbank Accession No.:AF003960):
CTCAAAAATACATCAACAAGCcccggtgtttatttatgaaaagatgctaagcaaaatgttttgtatgttggcaaagccaaa
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GB/T 34728—2017
agctaaaaaaacacttaaagtcttaggcatcaatatacctgtaattggactagtaaaaaatgaatatcataaaacaagagcattaattgatttgaacttaa
atgaaatttatgttaatgacttagaactgcataattatttagcacaaattcaaattgaggtagatagatttgctaagtcgcactttagaaatagacaaaaa
attagctcacttgaaggtaaactaagaaacattaaaggcctaggacacaatatggagcaaaagcttttaaatcattttaaaagctatgccaagatTTA
TGATGCATCAGTTGAAG(1624 bp)
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